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Una diagnosi completa per comprendere le difese immunitarie acquisite verso il SARS-CoV-2

L’epidemia di SARS-CoV-2 e il suo impatto sulla popolazione mondiale dimostrano l’importanza vitale delle procedure di test che possono riflettere il progresso delle infezioni.

Una diagnosi completa che consideri tutti i pilastri del sistema immunitario è fondamentale per determinare lo stato del paziente al fine di avviare interventi mirati, nonché per comprendere eventuali difese immunitarie acquisite.

L’infezione è clinicamente asintomatica o moderata nella maggior parte dei soggetti. In alcuni casi, l’infezione provoca una grave progressione che può portare anche ad un quadro clinico molto grave.

Per confermare la presenza di RNA virale o di anticorpi SARS-CoV-2 vengono comunemente utilizzati due tipi di test:

  • test RT-PCR (reazione a catena della polimerasi in tempo reale) con tamponi oro-faringei e/o salivari sono usati per eventualmente confermare la presenza di RNA virale

  • Il test anticorpale, comunemente detto “sierologico”, utilizza il rilevamento del braccio adattativo umorale (acquisito) del sistema immune (misurazione degli anticorpi circolanti).

Tuttavia, è sempre più dimostrato che le risposte anticorpali non sono sempre rilevabili, anche quando il soggetto è stato chiaramente esposto/infetto.

Le reazioni delle cellule immunitarie contro il SARS-CoV-2 possono essere rilevate per un periodo di tempo più lungo

La risposta cellulare, l’altro braccio del sistema immunitario, è ora riconosciuta come strumento di analisi importante  per la misurazione degli anticorpi circolanti contro il SARS-CoV-2. Infatti, è la prima linea di difesa del nostro organismo.

Il sistema immunitario cellulare, e in particolare le cellule T, controllano la forza della risposta immunitaria rilasciando citochine per aumentare o sopprimere la risposta, a seconda della carica virale. Il rilevamento di cellule T reattive (cellule effettrici) contro un agente patogeno indica un contatto e quindi un’infezione acuta o pregressa, indipendentemente dal fatto che siano stati prodotti anticorpi.

È interessante notare che in molti casi le reazioni delle cellule T contro SARS-CoV possono essere rilevate per un periodo di tempo più lungo rispetto ai titoli anticorpali. Anche tutta la vita grazie alla memoria immunitaria.

EliSpot-Assay per misurare la risposta immunitaria dopo l’infezione da Coronavirus

L’EliSpot-Assay (Enzyme-linked Immuno-Spot Assay) è in grado di rilevare le reazioni dei linfociti T a livello delle singole cellule e quindi caratterizzare la risposta immunitaria individuale degli individui che sono stati esposti al virus.
Il rilascio di citochine delle cellule T stimolate con antigeni specifici del coronavirus fornisce un quadro differenziato della risposta immunitaria per mostrare lo sviluppo della progressione della malattia e la possibile immunità dopo l’infezione.

 

Principio del saggio EliSpot a fluorescenza a 2 colori (iSpot). Una piastra a 96 pozzetti, rivestita con anticorpi contro le citochine desiderate, viene incubata con PBMC isolati e antigeni del patogeno di interesse per 24 ore. Successivamente, le cellule vengono rimosse e le citochine legate vengono colorate con anticorpi specifici, in questo caso Interferone-y (IFNy) e Interleuchina-2 (IL-2). Questi anticorpi vengono visualizzati in una seconda fase con anticorpi marcati con fluorescenza per generare macchie, che rappresentano una cellula che produce citochine.

 

L’EliSpot Assay (Enzyme-linked Immuno-Spot Assay) è in grado di rilevare le risposte delle cellule T a livello di singola cellula e quindi caratterizza la risposta immunitaria degli individui testati. La visualizzazione delle citochine secrete prodotte dalle cellule T, stimolate con antigeni specifici del coronavirus, fornisce un quadro differenziato della risposta immunitaria per monitorare la progressione della malattia e determinare l’immunità cellulare dopo l’infezione.

I titoli anticorpali individualmente in rapida diminuzione sono descritti anche in recenti pubblicazioni su SARS-CoV-2.

A causa dell’elevata somiglianza con SARS-CoV, il rilevamento della risposta delle cellule T contro SARS- CoV-2 fornisce ulteriori e importanti informazioni sullo stato del sistema immunitario nelle persone infette e guarite (anche per soggetti che non sanno di avere avuto l’infezione per mancanza di sintomi).

Questo sistema di monitoraggio visualizza l’espressione di IFN-γ (interferone- gamma, cellule T attivate) e IL-2 (interleuchina 2, cellule T di memoria) da cellule T funzionali specifiche contro SARS-CoV-2.

Il principio del test T-CEA SARS-CoV-2

Principio del saggio EliSpot a fluorescenza a 2 colori (iSpot). Una piastra a 96 pozzetti, rivestita con anticorpi contro le citochine desiderate, viene incubata con PBMC isolati e antigeni del patogeno di interesse per 24 ore. Successivamente, le cellule vengono rimosse e le citochine legate vengono colorate con anticorpi specifici, in questo caso Interferone-y (IFNy) e Interleuchina-2 (IL-2). Questi anticorpi vengono visualizzati in una seconda fase con anticorpi marcati con fluorescenza per generare macchie, che rappresentano una cellula che produce citochine.

 

Confronto di cellule T helper 1 (Th1) che esprimono IFNy e IL-2 nel contesto dell’infezione. I linfociti T attivati esprimono principalmente IFNy (visualizzato con macchie fluorescenti verdi) a causa della persistenza dell’antigene, di un elevato carico di antigene e/o di un’esposizione o riesposizione acuta dell’antigene. Durante il corso dell’infezione, sorgono cellule T di memoria, che esprimono IL-2 (visualizzata dai punti fluorescenti rossi), e principalmente cellule T a doppia colorazione (fluorescenza gialla) sono visibili a causa della coespressione di IFNy e IL-2. Più a lungo l’infezione viene superata o il carico di antigene viene eliminato principalmente, una reazione dominante delle cellule T memoria IL-2 è visibile mostrata esclusivamente da macchie rosse.

Confronto tra cellule T da donatore post infezione Covid e donatore vaccinato Biontech/Pfizer 

Cellule T CD4+ e CD8+ da donatore infettato naturalmente (A) e vaccinato con Biontech (B), stimolate con SARS-CoV-2 Mix. Le PBMC sono state isolate da due donatori, uno infetto naturalmente 8 settimane fa e un donatore vaccinato con Biontech/Pfizer 2 settimane dopo la seconda immunizzazione. Da questi PBMC, le cellule T CD4+ e CD8+ sono state isolate mediante l’uso di un kit commerciale e il metodo di separazione delle sfere magnetiche. Sia le preparazioni cellulari che le PBMC intatte (immagini non mostrate) sono state utilizzate per CoV EliSpot per determinare la partecipazione delle cellule Th1 e/o Th2 dopo l’infezione naturale e la vaccinazione. Senza alcun dubbio, esclusivamente le cellule T CD4+ e quindi solo le cellule Thelper sono responsabili della risposta immunitaria cellulare, in maniera irrilevante se da vaccino o naturalmente da infezione, come mostrano chiaramente le immagini e i numeri delle macchie.

L’importanza delle Cellule T per una risposta immunitaria efficace 

Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono fondamentalmente diverse. La risposta immunitaria cellulare è dipendente dalle cellule T.

Le cellule T sono suddivise in diverse sottopopolazioni (ad esempio Th1 e Th2), che rilasciano citochine diverse a seconda della loro funzione. Alcune di queste citochine innescano la risposta immunitaria umorale. Le cellule T sono quindi all’inizio dei meccanismi di difesa acquisiti. Le diverse sottopopolazioni di cellule T sono il sito centrale della risposta immunitaria sia umorale che cellulare.

Le cellule T effettrici sono cellule T direttamente attivate e differenziate che hanno proprietà pro-infiammatorie. Sono prodotti da cellule T “vergini” dopo essere venute a contatto con il particolare antigene durante un’infezione o una vaccinazione. Dopo la differenziazione proliferano in cloni di cellule T patogeni specifici, che si trovano come cellule T effettori e di memoria nel sangue periferico.

I linfociti T regolatori sopprimono la risposta immunitaria. Come le cellule T effettrici, si formano per differenziazione dalle cellule T native. Un equilibrio tra cellule T effettrici attivate e cellule T regolatorie è fondamentale per una risposta immunitaria efficace e protettiva. Un equilibrio disturbato può essere alla base di una malattia autoimmune o di un processo infiammatorio cronico.

Rilevamento degli anticorpi in caso di infezione Covid-19 (SARS-CoV-2) asintomatica o con sintomi lievi

Nel rilevamento indiretto di una precedente infezione da COVID-19 soprattutto nei pazienti asintomatici o con sintomi lievi, spesso non si riscontrano titoli anticorpali di una certa entità e comunque molto spesso diminuiscono rapidamente.

Molte persone si liberano dell’agente infettivo usando il loro sistema immunitario cellulare prima che vengano prodotti gli anticorpi. Le precedenti infezioni da COVID-19 possono essere rilevate efficacemente rilevando i Linfociti T effettori specifici (o anche non specifici ma che hanno in comune lo stesso determinante antigienico) di SARS-CoV-2 o le cellule di memoria.

Rilevamento dell’immunità cellulare può indicare immunità esistente o pre-esistente 

Se è possibile rilevare cloni di cellule T specifici per SARS-CoV-2, questa non è solo una prova di un precedente contatto virale: il rilevamento può anche indicare un’immunità cellulare esistente o pre-esistente. Questo è particolarmente vero se il rilevamento di IL-2 o un rilevamento combinato di IL-2 e INF-γ rivela evidenza di cellule di memoria.

Secondo i primi studi, le risposte delle cellule T specifiche per SARS-CoV-2 rimangono rilevabili a lungo nel CoV-iSpot. Risposte anticorpali relativamente di breve durata ma immunità delle cellule T di lunga durata significa che cellule di memoria T specifiche per la SARS sono state osservate nei pazienti infettati da SARS dal 2003 al 2020.

Indicazione di possibile immunità contro i Coronavirus in generale

Nel T-CEA, vengono utilizzati anche altri Coronavirus per stimolare i linfociti al fine di chiarire la questione dell’immunità di base del sistema immunitario cellulare dopo un precedente contatto con coronavirus endemici a livello globale. Se il T-CEA mostra prove di risposte delle cellule T specifiche verso i coronavirus in generale e se questi pazienti non sviluppano la malattia o solo sintomi lievi dopo l’infezione da SARS-CoV-2, allora sembra molto probabile una risposta cellulare contro i coronavirus in generale.

L’osservazione che i pazienti con una risposta reattiva ai peptidi dei coronavirus spesso non risultano positivi agli anticorpi anti-SARS-CoV-2 suggerisce anche un’immunità cellulare di base. È possibile che le cellule infettate da virus siano state eliminate dalle cellule effettrici T prima di essere stimolate dalle plasmacellule agli anticorpi.

Domande e risposte

Il T-CEA SARS-CoV-2 test può essere utile per valutare l’immunità relativamente alla vaccinazione?

Sì, sia i vaccini a mRNA che a vettore virale o a DNA sono stati progettati per neutralizzare il peptide S virale.
Il mix di Peptidi utilizzato in questo test utilizza anche la proteina S. In conclusione, se i Linfociti T “sollecitati” dalla presenza della proteina S virale reagiscono, significa che c’è immunità e quindi protezione.

Il test T-CEA SARS-CoV-2 può rilevare una risposta immunitaria a una variante mutata di SARS-CoV-2?

Sì. Di oltre 10.000 mutazioni caratterizzate di SARS-CoV-2, le varianti di interesse sono Alpha, Beta, Gamma e Delta. Tutti questi sono caratterizzati da mutazioni nella regione del gene S. Come mostrato nella figura sottostante, queste mutazioni non interferiscono con il mix di peptidi nel T-CEA SARS-CoV-2.

 

 

Contatta la nostra segreteria per effettuare il test T-CEA (valutazione degli anticorpi Covid)

 

 

Linfociti T effettori e della memori a-Immunità eterologa e sars-cov-2

Bibliografia 

 

Dott. Mauro Mantovani

Responsabile Ricerca e Sviluppo IMBIO
Direttore Scientifico IMBIO Academy

Riferimenti: Linfociti T, Covid-19, Anticorpi SARS-CoV-2
Redattore: Dott. Mauro Mantovani

 



Un nuovo studio, presente su PUBMED e pubblicato a Marzo su Alternative Therapies in health and medicine, correla un risultato positivo del test ALCAT® agli zuccheri fruttosio, canna da zucchero barbabietola da zucchero, alla mutazione del gene TCF7L2, legata all’insulino-resistenza e alla predisposizione al diabete di tipo II.

La resistenza all’insulina (RI) è definita come l’incapacità di una quantità nota di insulina esogena o endogena di aumentare l’assorbimento e l’utilizzo del glucosio. Diversi meccanismi sono stati proposti come possibili cause alla base dello sviluppo della RI e della sindrome RI. La resistenza insulinica fa parte di un gruppo di anomalie metabolico-cardiovascolari comunemente note come “Sindrome metabolica”. Essa può portare allo sviluppo di diabete di tipo 2, aterosclerosi, ipertensione, dismenorrea, irsutismo e sindrome dell’ovaio policistico, a seconda del background genetico del singolo individuo. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare, in 123 donne e 35 maschi (età media, 42 y ± 10.3, range 19-75 y) volontari se la resistenza insulinica potesse essere in parte correlata ad un’intolleranza allo zucchero nella dieta e se ci potesse essere una correlazione tra il test di intolleranza ALCAT e una mutazione del gene TCF7TL2 . Tale gene promuove infatti la trascrizione del proglucagone e svolge un ruolo chiave nello sviluppo delle isole di Langherans. I risultati hanno evidenziato, in maniera statisticamente significativa, che i soggetti con intolleranza allo zucchero presentano anche un’alterazione (completa o parziale)  del gene TCF7TL2. Sulla base di questi risultati, il nostro studio ha dimostrato che esiste una correlazione clinica tra il test di intolleranza alimentare ALCAT e la resistenza insulinca. La positività al test ALCAT di uno degli zuccheri testati (fruttosio, canna da zucchero e barbabietola da zucchero) indica, nella maggior parte dei soggetti, la presenza di una mutazione del gene TCF7L2 e potrebbe contribuire alla prevenzione e al trattamento della RI.

Leggi l’articolo originale su Pub Med

Altern Ther Health Med. 2019 Mar;25(2):22-38.

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