Articoli

Tutto sul nostro settore


Una diagnosi completa per comprendere le difese immunitarie acquisite verso il SARS-CoV-2

L’epidemia di SARS-CoV-2 e il suo impatto sulla popolazione mondiale dimostrano l’importanza vitale delle procedure di test che possono riflettere il progresso delle infezioni.

Una diagnosi completa che consideri tutti i pilastri del sistema immunitario è fondamentale per determinare lo stato del paziente al fine di avviare interventi mirati, nonché per comprendere eventuali difese immunitarie acquisite.

L’infezione è clinicamente asintomatica o moderata nella maggior parte dei soggetti. In alcuni casi, l’infezione provoca una grave progressione che può portare anche ad un quadro clinico molto grave.

Per confermare la presenza di RNA virale o di anticorpi SARS-CoV-2 vengono comunemente utilizzati due tipi di test:

  • test RT-PCR (reazione a catena della polimerasi in tempo reale) con tamponi oro-faringei e/o salivari sono usati per eventualmente confermare la presenza di RNA virale

  • Il test anticorpale, comunemente detto “sierologico”, utilizza il rilevamento del braccio adattativo umorale (acquisito) del sistema immune (misurazione degli anticorpi circolanti).

Tuttavia, è sempre più dimostrato che le risposte anticorpali non sono sempre rilevabili, anche quando il soggetto è stato chiaramente esposto/infetto.

Le reazioni delle cellule immunitarie contro il SARS-CoV-2 possono essere rilevate per un periodo di tempo più lungo

La risposta cellulare, l’altro braccio del sistema immunitario, è ora riconosciuta come strumento di analisi importante  per la misurazione degli anticorpi circolanti contro il SARS-CoV-2. Infatti, è la prima linea di difesa del nostro organismo.

Il sistema immunitario cellulare, e in particolare le cellule T, controllano la forza della risposta immunitaria rilasciando citochine per aumentare o sopprimere la risposta, a seconda della carica virale. Il rilevamento di cellule T reattive (cellule effettrici) contro un agente patogeno indica un contatto e quindi un’infezione acuta o pregressa, indipendentemente dal fatto che siano stati prodotti anticorpi.

È interessante notare che in molti casi le reazioni delle cellule T contro SARS-CoV possono essere rilevate per un periodo di tempo più lungo rispetto ai titoli anticorpali. Anche tutta la vita grazie alla memoria immunitaria.

EliSpot-Assay per misurare la risposta immunitaria dopo l’infezione da Coronavirus

L’EliSpot-Assay (Enzyme-linked Immuno-Spot Assay) è in grado di rilevare le reazioni dei linfociti T a livello delle singole cellule e quindi caratterizzare la risposta immunitaria individuale degli individui che sono stati esposti al virus.
Il rilascio di citochine delle cellule T stimolate con antigeni specifici del coronavirus fornisce un quadro differenziato della risposta immunitaria per mostrare lo sviluppo della progressione della malattia e la possibile immunità dopo l’infezione.

 

Principio del saggio EliSpot a fluorescenza a 2 colori (iSpot). Una piastra a 96 pozzetti, rivestita con anticorpi contro le citochine desiderate, viene incubata con PBMC isolati e antigeni del patogeno di interesse per 24 ore. Successivamente, le cellule vengono rimosse e le citochine legate vengono colorate con anticorpi specifici, in questo caso Interferone-y (IFNy) e Interleuchina-2 (IL-2). Questi anticorpi vengono visualizzati in una seconda fase con anticorpi marcati con fluorescenza per generare macchie, che rappresentano una cellula che produce citochine.

 

L’EliSpot Assay (Enzyme-linked Immuno-Spot Assay) è in grado di rilevare le risposte delle cellule T a livello di singola cellula e quindi caratterizza la risposta immunitaria degli individui testati. La visualizzazione delle citochine secrete prodotte dalle cellule T, stimolate con antigeni specifici del coronavirus, fornisce un quadro differenziato della risposta immunitaria per monitorare la progressione della malattia e determinare l’immunità cellulare dopo l’infezione.

I titoli anticorpali individualmente in rapida diminuzione sono descritti anche in recenti pubblicazioni su SARS-CoV-2.

A causa dell’elevata somiglianza con SARS-CoV, il rilevamento della risposta delle cellule T contro SARS- CoV-2 fornisce ulteriori e importanti informazioni sullo stato del sistema immunitario nelle persone infette e guarite (anche per soggetti che non sanno di avere avuto l’infezione per mancanza di sintomi).

Questo sistema di monitoraggio visualizza l’espressione di IFN-γ (interferone- gamma, cellule T attivate) e IL-2 (interleuchina 2, cellule T di memoria) da cellule T funzionali specifiche contro SARS-CoV-2.

Il principio del test T-CEA SARS-CoV-2

Principio del saggio EliSpot a fluorescenza a 2 colori (iSpot). Una piastra a 96 pozzetti, rivestita con anticorpi contro le citochine desiderate, viene incubata con PBMC isolati e antigeni del patogeno di interesse per 24 ore. Successivamente, le cellule vengono rimosse e le citochine legate vengono colorate con anticorpi specifici, in questo caso Interferone-y (IFNy) e Interleuchina-2 (IL-2). Questi anticorpi vengono visualizzati in una seconda fase con anticorpi marcati con fluorescenza per generare macchie, che rappresentano una cellula che produce citochine.

 

Confronto di cellule T helper 1 (Th1) che esprimono IFNy e IL-2 nel contesto dell’infezione. I linfociti T attivati esprimono principalmente IFNy (visualizzato con macchie fluorescenti verdi) a causa della persistenza dell’antigene, di un elevato carico di antigene e/o di un’esposizione o riesposizione acuta dell’antigene. Durante il corso dell’infezione, sorgono cellule T di memoria, che esprimono IL-2 (visualizzata dai punti fluorescenti rossi), e principalmente cellule T a doppia colorazione (fluorescenza gialla) sono visibili a causa della coespressione di IFNy e IL-2. Più a lungo l’infezione viene superata o il carico di antigene viene eliminato principalmente, una reazione dominante delle cellule T memoria IL-2 è visibile mostrata esclusivamente da macchie rosse.

Confronto tra cellule T da donatore post infezione Covid e donatore vaccinato Biontech/Pfizer 

Cellule T CD4+ e CD8+ da donatore infettato naturalmente (A) e vaccinato con Biontech (B), stimolate con SARS-CoV-2 Mix. Le PBMC sono state isolate da due donatori, uno infetto naturalmente 8 settimane fa e un donatore vaccinato con Biontech/Pfizer 2 settimane dopo la seconda immunizzazione. Da questi PBMC, le cellule T CD4+ e CD8+ sono state isolate mediante l’uso di un kit commerciale e il metodo di separazione delle sfere magnetiche. Sia le preparazioni cellulari che le PBMC intatte (immagini non mostrate) sono state utilizzate per CoV EliSpot per determinare la partecipazione delle cellule Th1 e/o Th2 dopo l’infezione naturale e la vaccinazione. Senza alcun dubbio, esclusivamente le cellule T CD4+ e quindi solo le cellule Thelper sono responsabili della risposta immunitaria cellulare, in maniera irrilevante se da vaccino o naturalmente da infezione, come mostrano chiaramente le immagini e i numeri delle macchie.

L’importanza delle Cellule T per una risposta immunitaria efficace 

Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono fondamentalmente diverse. La risposta immunitaria cellulare è dipendente dalle cellule T.

Le cellule T sono suddivise in diverse sottopopolazioni (ad esempio Th1 e Th2), che rilasciano citochine diverse a seconda della loro funzione. Alcune di queste citochine innescano la risposta immunitaria umorale. Le cellule T sono quindi all’inizio dei meccanismi di difesa acquisiti. Le diverse sottopopolazioni di cellule T sono il sito centrale della risposta immunitaria sia umorale che cellulare.

Le cellule T effettrici sono cellule T direttamente attivate e differenziate che hanno proprietà pro-infiammatorie. Sono prodotti da cellule T “vergini” dopo essere venute a contatto con il particolare antigene durante un’infezione o una vaccinazione. Dopo la differenziazione proliferano in cloni di cellule T patogeni specifici, che si trovano come cellule T effettori e di memoria nel sangue periferico.

I linfociti T regolatori sopprimono la risposta immunitaria. Come le cellule T effettrici, si formano per differenziazione dalle cellule T native. Un equilibrio tra cellule T effettrici attivate e cellule T regolatorie è fondamentale per una risposta immunitaria efficace e protettiva. Un equilibrio disturbato può essere alla base di una malattia autoimmune o di un processo infiammatorio cronico.

Rilevamento degli anticorpi in caso di infezione Covid-19 (SARS-CoV-2) asintomatica o con sintomi lievi

Nel rilevamento indiretto di una precedente infezione da COVID-19 soprattutto nei pazienti asintomatici o con sintomi lievi, spesso non si riscontrano titoli anticorpali di una certa entità e comunque molto spesso diminuiscono rapidamente.

Molte persone si liberano dell’agente infettivo usando il loro sistema immunitario cellulare prima che vengano prodotti gli anticorpi. Le precedenti infezioni da COVID-19 possono essere rilevate efficacemente rilevando i Linfociti T effettori specifici (o anche non specifici ma che hanno in comune lo stesso determinante antigienico) di SARS-CoV-2 o le cellule di memoria.

Rilevamento dell’immunità cellulare può indicare immunità esistente o pre-esistente 

Se è possibile rilevare cloni di cellule T specifici per SARS-CoV-2, questa non è solo una prova di un precedente contatto virale: il rilevamento può anche indicare un’immunità cellulare esistente o pre-esistente. Questo è particolarmente vero se il rilevamento di IL-2 o un rilevamento combinato di IL-2 e INF-γ rivela evidenza di cellule di memoria.

Secondo i primi studi, le risposte delle cellule T specifiche per SARS-CoV-2 rimangono rilevabili a lungo nel CoV-iSpot. Risposte anticorpali relativamente di breve durata ma immunità delle cellule T di lunga durata significa che cellule di memoria T specifiche per la SARS sono state osservate nei pazienti infettati da SARS dal 2003 al 2020.

Indicazione di possibile immunità contro i Coronavirus in generale

Nel T-CEA, vengono utilizzati anche altri Coronavirus per stimolare i linfociti al fine di chiarire la questione dell’immunità di base del sistema immunitario cellulare dopo un precedente contatto con coronavirus endemici a livello globale. Se il T-CEA mostra prove di risposte delle cellule T specifiche verso i coronavirus in generale e se questi pazienti non sviluppano la malattia o solo sintomi lievi dopo l’infezione da SARS-CoV-2, allora sembra molto probabile una risposta cellulare contro i coronavirus in generale.

L’osservazione che i pazienti con una risposta reattiva ai peptidi dei coronavirus spesso non risultano positivi agli anticorpi anti-SARS-CoV-2 suggerisce anche un’immunità cellulare di base. È possibile che le cellule infettate da virus siano state eliminate dalle cellule effettrici T prima di essere stimolate dalle plasmacellule agli anticorpi.

Domande e risposte

Il T-CEA SARS-CoV-2 test può essere utile per valutare l’immunità relativamente alla vaccinazione?

Sì, sia i vaccini a mRNA che a vettore virale o a DNA sono stati progettati per neutralizzare il peptide S virale.
Il mix di Peptidi utilizzato in questo test utilizza anche la proteina S. In conclusione, se i Linfociti T “sollecitati” dalla presenza della proteina S virale reagiscono, significa che c’è immunità e quindi protezione.

Il test T-CEA SARS-CoV-2 può rilevare una risposta immunitaria a una variante mutata di SARS-CoV-2?

Sì. Di oltre 10.000 mutazioni caratterizzate di SARS-CoV-2, le varianti di interesse sono Alpha, Beta, Gamma e Delta. Tutti questi sono caratterizzati da mutazioni nella regione del gene S. Come mostrato nella figura sottostante, queste mutazioni non interferiscono con il mix di peptidi nel T-CEA SARS-CoV-2.

 

 

Contatta la nostra segreteria per effettuare il test T-CEA (valutazione degli anticorpi Covid)

 

 

Linfociti T effettori e della memori a-Immunità eterologa e sars-cov-2

Bibliografia 

 

Dott. Mauro Mantovani

Responsabile Ricerca e Sviluppo IMBIO
Direttore Scientifico IMBIO Academy

Riferimenti: Linfociti T, Covid-19, Anticorpi SARS-CoV-2
Redattore: Dott. Mauro Mantovani

 



L’infezione parodontale, cos’è e quali sono i sintomi della parodontite?

L’infezione paradontale (o parodontite) è un’infiammazione dei tessuti che circondano e sostengono i denti, ovvero gengive, legamento parodontale ed osso alveolare. L’infezione si sviluppa a causa della colonizzazione di questi tessuti da parte di alcuni patogeni orali; mentre l’infiammazione si ha a causa della risposta immunitaria che ne consegue.

L’infezione parodontale può svilupparsi a livello sistemico e coinvolgere il sistema cardiovascolare, il sistema endocrino, il sistema riproduttivo ed il sistema respiratorio, e questo la rende una malattia multifase complessa.

La parodontite comporta un’infiammazione dovuta all’interazione tra l’infezione batterica e la risposta del sistema immunitario dell’ospite, e può portare a distruzione progressiva del legamento parodontale e dell’osso alveolare. Può anche portare a recessione delle gengive.

Non è chiaro come si sviluppi l’infezione parodontale, in quanto ogni individuo presenta una propria composizione microbica orale, ed ognuno mostra una diversa risposta immunitaria all’infezione: ne consegue che ogni infezione dei tessuti orali è da considerarsi a sé.

Esistono più di 500 specie batteriche diverse in grado di colonizzare la bocca di un adulto. Alcune delle specie più diffuse responsabili di infezione sono:

  • Porphyromonas gingivalis
  • Prevotella intermedia
  • Bacteroides forsythus
  • Campilobacter rectus
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans.

Correlazione tra parodontite ed altre malattie

Sono state sviluppate molte tecniche per poter analizzare la composizione della placca dentale e stabilire qual è la prevalenza batterica nel cavo orale del paziente.

Recenti studi suggeriscono che l’infezione parodontale può aumentare il rischio di alcune malattie, tra cui le malattie coronariche ed eventi collegati ad esse, come angina ed infarto, aterosclerosi, ictus, diabete mellito, parto pretermine, parto con basso peso alla nascita e patologie respiratorie varie.

Questo avviene perché la parodontite avvia un’infiammazione sistemica, che può essere monitorata da marcatori infiammatori come la proteina C-reattiva, i livelli di fibrinogeno e le citochine salivari.

Scopri il ruolo delle citochine come marker infiammatori con l’analisi salivare delle citochine

Quando parliamo di parodontite, parliamo di infezioni del cavo orale: esiste un equilibrio tra la presenza microbica e la risposta immunitaria dell’ospite; se questo equilibrio viene perturbato, si sviluppa la malattia parodontale. La peculiarità dei patogeni del microbiota orale è che questi possono interagire con i tessuti dell’ospite anche senza penetrazione diretta nei tessuti.

A livello dei denti, i microrganismi nel cavo orale formano un biofilm, ovvero un’aggregazione di specie microscopiche che coesistono, che prende il nome di placca dentale.

La cavità orale è una fonte continua di agenti infettivi e le condizioni di questa riflettono spesso la progressione delle patologie sistemiche. Il cavo orale sembra fungere da serbatoio batterico.

L’omeostasi parodontale, la patogenesi della parodontite cronica ed il ruolo delle citochine coinvolte

Il tessuto parodontale, proprio come gli altri tessuti del nostro corpo, si rinnova periodicamente. Questo processo di sostituzione delle cellule “vecchie” con le cellule “nuove” prende il nome di turnover. Se il paziente è in salute, vi è un equilibrio tra il turnover cellulare ed una risposta immunitaria dell’ospite.

Il sistema immunitario a livello del cavo orale è stimolato sia dal microbiota commensale (ovvero da quello che “convive” abitualmente nella bocca dell’ospite), che dalla stimolazione meccanica della masticazione.

Nel solco gengivale si trovano normalmente alcuni neutrofili ed altre cellule del sistema immunitario, comprese le cellule Th17 e le cellule dell’immunità innata. Se però il microbiota abituale del paziente viene alterato dalla presenza di microrganismi patogeni, la risposta immunitaria si attiva in maniera eccessiva e nel tentativo di eliminare i patogeni, distrugge i tessuti.

Durante l’infiammazione vengono prodotte diverse citochine nei tessuti di infezione

L’interazione tra microbiota, patogeno e sistema immunitario porta alla secrezione di citochine, che vanno a loro volta ad aumentare l’infiammazione, richiamando altre cellule del sistema immunitario, più specifiche contro il patogeno riconosciuto. Inoltre, da un sottogruppo cellulare del sistema immunitario, viene secreto anche un altro tipo di citochine, che ha il compito di differenziare uno specifico sottoinsieme di linfociti.

Le citochine vengono secrete da diversi gruppi cellulari, e possono agire sia come amplificatori dell’infiammazione, che come responsabili diretti della distruzione dei tessuti.

La rete delle citochine nella patogenesi della parodontite

In breve, le citochine proinfiammatorie IL-1, IL-6 e TNF-alpha vengono secrete dalle cellule parodontali e dalle cellule del sistema immunitario dell’ospite dopo la stimolazione da parte dei microbi e provocano danni diretti ai tessuti.

A questo punto le altre cellule del sistema immunitario, tra cui le cellule T-indifferenziate e le cellule B, si differenziano in cellule T-mature attive contro il patogeno o in plasmacellule (le cellule in grado di secernere gli anticorpi). Queste cellule, sotto la stimolazione delle citochine, possono attivare o promuovere altre cellule effettrici, che esercitano effetti pro-infiammatori o anti-infiammatori.

Tra i diversi attori cellulari che agiscono in questi casi abbiamo le cellule TH1 e T-regolatrici che possono agire come protettori, mentre le cellule TH2/B e TH17 possono agire sia come distruttori dei tessuti, che come protettori.

Al fine di valutare il grado di infiammazione è consigliata la ricerca di alcune citochine: IL-1Beta, TNF-alfa e IL-6 (azione pro-infiammatoria) ed IL-17A ed IL-22 (azione protettiva).

Misura con un test non invasivo su saliva il grado di infiammazione e contattaci per una consulenza personalizzata

 

Dott.ssa Giulia Aliboni 

Biologo nutrizionista

Testo scientifico a cura del Dott. Mauro Mantovani

Responsabile Ricerca e Sviluppo IMBIO
Direttore Scientifico IMBIO Academy

Riferimenti: Citochine, Paradontite, Risposta immunitaria
Redattore: Dott.ssa Giulia Aliboni

Copyright by IMBIO 2017. All rights reserved.