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Una diagnosi completa per comprendere le difese immunitarie acquisite verso il SARS-CoV-2

L’epidemia di SARS-CoV-2 e il suo impatto sulla popolazione mondiale dimostrano l’importanza vitale delle procedure di test che possono riflettere il progresso delle infezioni.

Una diagnosi completa che consideri tutti i pilastri del sistema immunitario è fondamentale per determinare lo stato del paziente al fine di avviare interventi mirati, nonché per comprendere eventuali difese immunitarie acquisite.

L’infezione è clinicamente asintomatica o moderata nella maggior parte dei soggetti. In alcuni casi, l’infezione provoca una grave progressione che può portare anche ad un quadro clinico molto grave.

Per confermare la presenza di RNA virale o di anticorpi SARS-CoV-2 vengono comunemente utilizzati due tipi di test:

  • test RT-PCR (reazione a catena della polimerasi in tempo reale) con tamponi oro-faringei e/o salivari sono usati per eventualmente confermare la presenza di RNA virale

  • Il test anticorpale, comunemente detto “sierologico”, utilizza il rilevamento del braccio adattativo umorale (acquisito) del sistema immune (misurazione degli anticorpi circolanti).

Tuttavia, è sempre più dimostrato che le risposte anticorpali non sono sempre rilevabili, anche quando il soggetto è stato chiaramente esposto/infetto.

Le reazioni delle cellule immunitarie contro il SARS-CoV-2 possono essere rilevate per un periodo di tempo più lungo

La risposta cellulare, l’altro braccio del sistema immunitario, è ora riconosciuta come strumento di analisi importante  per la misurazione degli anticorpi circolanti contro il SARS-CoV-2. Infatti, è la prima linea di difesa del nostro organismo.

Il sistema immunitario cellulare, e in particolare le cellule T, controllano la forza della risposta immunitaria rilasciando citochine per aumentare o sopprimere la risposta, a seconda della carica virale. Il rilevamento di cellule T reattive (cellule effettrici) contro un agente patogeno indica un contatto e quindi un’infezione acuta o pregressa, indipendentemente dal fatto che siano stati prodotti anticorpi.

È interessante notare che in molti casi le reazioni delle cellule T contro SARS-CoV possono essere rilevate per un periodo di tempo più lungo rispetto ai titoli anticorpali. Anche tutta la vita grazie alla memoria immunitaria.

EliSpot-Assay per misurare la risposta immunitaria dopo l’infezione da Coronavirus

L’EliSpot-Assay (Enzyme-linked Immuno-Spot Assay) è in grado di rilevare le reazioni dei linfociti T a livello delle singole cellule e quindi caratterizzare la risposta immunitaria individuale degli individui che sono stati esposti al virus.
Il rilascio di citochine delle cellule T stimolate con antigeni specifici del coronavirus fornisce un quadro differenziato della risposta immunitaria per mostrare lo sviluppo della progressione della malattia e la possibile immunità dopo l’infezione.

 

Principio del saggio EliSpot a fluorescenza a 2 colori (iSpot). Una piastra a 96 pozzetti, rivestita con anticorpi contro le citochine desiderate, viene incubata con PBMC isolati e antigeni del patogeno di interesse per 24 ore. Successivamente, le cellule vengono rimosse e le citochine legate vengono colorate con anticorpi specifici, in questo caso Interferone-y (IFNy) e Interleuchina-2 (IL-2). Questi anticorpi vengono visualizzati in una seconda fase con anticorpi marcati con fluorescenza per generare macchie, che rappresentano una cellula che produce citochine.

 

L’EliSpot Assay (Enzyme-linked Immuno-Spot Assay) è in grado di rilevare le risposte delle cellule T a livello di singola cellula e quindi caratterizza la risposta immunitaria degli individui testati. La visualizzazione delle citochine secrete prodotte dalle cellule T, stimolate con antigeni specifici del coronavirus, fornisce un quadro differenziato della risposta immunitaria per monitorare la progressione della malattia e determinare l’immunità cellulare dopo l’infezione.

I titoli anticorpali individualmente in rapida diminuzione sono descritti anche in recenti pubblicazioni su SARS-CoV-2.

A causa dell’elevata somiglianza con SARS-CoV, il rilevamento della risposta delle cellule T contro SARS- CoV-2 fornisce ulteriori e importanti informazioni sullo stato del sistema immunitario nelle persone infette e guarite (anche per soggetti che non sanno di avere avuto l’infezione per mancanza di sintomi).

Questo sistema di monitoraggio visualizza l’espressione di IFN-γ (interferone- gamma, cellule T attivate) e IL-2 (interleuchina 2, cellule T di memoria) da cellule T funzionali specifiche contro SARS-CoV-2.

Il principio del test T-CEA SARS-CoV-2

Principio del saggio EliSpot a fluorescenza a 2 colori (iSpot). Una piastra a 96 pozzetti, rivestita con anticorpi contro le citochine desiderate, viene incubata con PBMC isolati e antigeni del patogeno di interesse per 24 ore. Successivamente, le cellule vengono rimosse e le citochine legate vengono colorate con anticorpi specifici, in questo caso Interferone-y (IFNy) e Interleuchina-2 (IL-2). Questi anticorpi vengono visualizzati in una seconda fase con anticorpi marcati con fluorescenza per generare macchie, che rappresentano una cellula che produce citochine.

 

Confronto di cellule T helper 1 (Th1) che esprimono IFNy e IL-2 nel contesto dell’infezione. I linfociti T attivati esprimono principalmente IFNy (visualizzato con macchie fluorescenti verdi) a causa della persistenza dell’antigene, di un elevato carico di antigene e/o di un’esposizione o riesposizione acuta dell’antigene. Durante il corso dell’infezione, sorgono cellule T di memoria, che esprimono IL-2 (visualizzata dai punti fluorescenti rossi), e principalmente cellule T a doppia colorazione (fluorescenza gialla) sono visibili a causa della coespressione di IFNy e IL-2. Più a lungo l’infezione viene superata o il carico di antigene viene eliminato principalmente, una reazione dominante delle cellule T memoria IL-2 è visibile mostrata esclusivamente da macchie rosse.

Confronto tra cellule T da donatore post infezione Covid e donatore vaccinato Biontech/Pfizer 

Cellule T CD4+ e CD8+ da donatore infettato naturalmente (A) e vaccinato con Biontech (B), stimolate con SARS-CoV-2 Mix. Le PBMC sono state isolate da due donatori, uno infetto naturalmente 8 settimane fa e un donatore vaccinato con Biontech/Pfizer 2 settimane dopo la seconda immunizzazione. Da questi PBMC, le cellule T CD4+ e CD8+ sono state isolate mediante l’uso di un kit commerciale e il metodo di separazione delle sfere magnetiche. Sia le preparazioni cellulari che le PBMC intatte (immagini non mostrate) sono state utilizzate per CoV EliSpot per determinare la partecipazione delle cellule Th1 e/o Th2 dopo l’infezione naturale e la vaccinazione. Senza alcun dubbio, esclusivamente le cellule T CD4+ e quindi solo le cellule Thelper sono responsabili della risposta immunitaria cellulare, in maniera irrilevante se da vaccino o naturalmente da infezione, come mostrano chiaramente le immagini e i numeri delle macchie.

L’importanza delle Cellule T per una risposta immunitaria efficace 

Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono fondamentalmente diverse. La risposta immunitaria cellulare è dipendente dalle cellule T.

Le cellule T sono suddivise in diverse sottopopolazioni (ad esempio Th1 e Th2), che rilasciano citochine diverse a seconda della loro funzione. Alcune di queste citochine innescano la risposta immunitaria umorale. Le cellule T sono quindi all’inizio dei meccanismi di difesa acquisiti. Le diverse sottopopolazioni di cellule T sono il sito centrale della risposta immunitaria sia umorale che cellulare.

Le cellule T effettrici sono cellule T direttamente attivate e differenziate che hanno proprietà pro-infiammatorie. Sono prodotti da cellule T “vergini” dopo essere venute a contatto con il particolare antigene durante un’infezione o una vaccinazione. Dopo la differenziazione proliferano in cloni di cellule T patogeni specifici, che si trovano come cellule T effettori e di memoria nel sangue periferico.

I linfociti T regolatori sopprimono la risposta immunitaria. Come le cellule T effettrici, si formano per differenziazione dalle cellule T native. Un equilibrio tra cellule T effettrici attivate e cellule T regolatorie è fondamentale per una risposta immunitaria efficace e protettiva. Un equilibrio disturbato può essere alla base di una malattia autoimmune o di un processo infiammatorio cronico.

Rilevamento degli anticorpi in caso di infezione Covid-19 (SARS-CoV-2) asintomatica o con sintomi lievi

Nel rilevamento indiretto di una precedente infezione da COVID-19 soprattutto nei pazienti asintomatici o con sintomi lievi, spesso non si riscontrano titoli anticorpali di una certa entità e comunque molto spesso diminuiscono rapidamente.

Molte persone si liberano dell’agente infettivo usando il loro sistema immunitario cellulare prima che vengano prodotti gli anticorpi. Le precedenti infezioni da COVID-19 possono essere rilevate efficacemente rilevando i Linfociti T effettori specifici (o anche non specifici ma che hanno in comune lo stesso determinante antigienico) di SARS-CoV-2 o le cellule di memoria.

Rilevamento dell’immunità cellulare può indicare immunità esistente o pre-esistente 

Se è possibile rilevare cloni di cellule T specifici per SARS-CoV-2, questa non è solo una prova di un precedente contatto virale: il rilevamento può anche indicare un’immunità cellulare esistente o pre-esistente. Questo è particolarmente vero se il rilevamento di IL-2 o un rilevamento combinato di IL-2 e INF-γ rivela evidenza di cellule di memoria.

Secondo i primi studi, le risposte delle cellule T specifiche per SARS-CoV-2 rimangono rilevabili a lungo nel CoV-iSpot. Risposte anticorpali relativamente di breve durata ma immunità delle cellule T di lunga durata significa che cellule di memoria T specifiche per la SARS sono state osservate nei pazienti infettati da SARS dal 2003 al 2020.

Indicazione di possibile immunità contro i Coronavirus in generale

Nel T-CEA, vengono utilizzati anche altri Coronavirus per stimolare i linfociti al fine di chiarire la questione dell’immunità di base del sistema immunitario cellulare dopo un precedente contatto con coronavirus endemici a livello globale. Se il T-CEA mostra prove di risposte delle cellule T specifiche verso i coronavirus in generale e se questi pazienti non sviluppano la malattia o solo sintomi lievi dopo l’infezione da SARS-CoV-2, allora sembra molto probabile una risposta cellulare contro i coronavirus in generale.

L’osservazione che i pazienti con una risposta reattiva ai peptidi dei coronavirus spesso non risultano positivi agli anticorpi anti-SARS-CoV-2 suggerisce anche un’immunità cellulare di base. È possibile che le cellule infettate da virus siano state eliminate dalle cellule effettrici T prima di essere stimolate dalle plasmacellule agli anticorpi.

Domande e risposte

Il T-CEA SARS-CoV-2 test può essere utile per valutare l’immunità relativamente alla vaccinazione?

Sì, sia i vaccini a mRNA che a vettore virale o a DNA sono stati progettati per neutralizzare il peptide S virale.
Il mix di Peptidi utilizzato in questo test utilizza anche la proteina S. In conclusione, se i Linfociti T “sollecitati” dalla presenza della proteina S virale reagiscono, significa che c’è immunità e quindi protezione.

Il test T-CEA SARS-CoV-2 può rilevare una risposta immunitaria a una variante mutata di SARS-CoV-2?

Sì. Di oltre 10.000 mutazioni caratterizzate di SARS-CoV-2, le varianti di interesse sono Alpha, Beta, Gamma e Delta. Tutti questi sono caratterizzati da mutazioni nella regione del gene S. Come mostrato nella figura sottostante, queste mutazioni non interferiscono con il mix di peptidi nel T-CEA SARS-CoV-2.

 

 

Contatta la nostra segreteria per effettuare il test T-CEA (valutazione degli anticorpi Covid)

 

 

Linfociti T effettori e della memori a-Immunità eterologa e sars-cov-2

Bibliografia 

 

Dott. Mauro Mantovani

Responsabile Ricerca e Sviluppo IMBIO
Direttore Scientifico IMBIO Academy

Riferimenti: Linfociti T, Covid-19, Anticorpi SARS-CoV-2
Redattore: Dott. Mauro Mantovani

 



September 17, 2020 Uncategorized

Test sierologico e tampone: come funzionano i test per diagnosticare l’infezione da Coronavirus?

Per verificare la presenza del virus COVID-19 in un soggetto esiste un solo modo: effettuare un tampone.
Il tampone oro-faringeo permette infatti, tramite un’ analisi delle mucose oro-faringee, di dichiarare se nell’ organismo di chi effettua il test se il virus è presente al momento del prelievo, oppure no.

Il tampone va quindi a misurare e quantificare in modo diretto la presenza dell’ agente patogeno. Questo ci permette quindi di determinare se in dato momento il soggetto sottoposto al test risulta essere portatore del virus e quindi contagioso.

Ma allora qual’è la differenza fra un tampone ed un test sierologico?

Il test sierologico, effettuato su siero, non è in grado di definire se un soggetto sia contagioso o meno, ma ci dà informazioni su un possibile contatto con il virus da parte della persona che effettua l’esame.

Il test sierologico per Covid-19 va a misurare due tipologie di anticorpi: IgG e IgM, che vengono prodotti in un organismo in seguito ad un contatto con un virus. Il test quindi non verifica direttamente la presenza del virus, ma va a cercare le “tracce” che il COVID-19 lascia nel sangue, senza poter però chiarire con certezza se l’agente patogeno sia ancora presente o meno al momento del prelievo.

Contatta la nostra segreteria per richiedere il test sierologico e il tampone


Che differenze ci sono fra le IgG e le IgM?

Le immunoglobuline M (IgM) sono gli anticorpi che vengono prodotti nella prima fase dell’ infezione da COVID-19, se quest’ ultime sono presenti la possibilità che il soggetto sia contagioso sono alte.

Al contrario le immunoglobuline G (IgG) sono più tardive e persistono nell’ organismo anche dopo che il virus viene debellato.

Un soggetto il cui test sierologico evidenzia solo la presenza di IgG potrebbe essere contagioso ma potrebbe anche non esserlo. Per definire ciò, come spiegato in precedenza occorre effettuare un tampone. È però doveroso sottolineare che questi anticorpi vengono prodotti dopo un “periodo finestra” che può durare fino a 7/10 giorni, un test sierologico negativo non esclude quindi la presenza effettiva del virus al momento del prelievo.

Domande frequenti

Il mio test sierologico ha evidenziato la presenza di IgG e IgM (o solo una delle due), sono contagioso?

Non è possibile rispondere a questa domanda, per saperlo bisogna effettuare un tampone.

Il mio test sierologico è negativo, quindi sicuramente non ho il COVID-19?

Non è possibile rispondere a questa domanda, esiste la possibilità che il virus sia presente nell’ organismo ma il soggetto non abbia ancora iniziato la produzione di anticorpi, per saperlo bisogna effettuare un tampone.

Il mio tampone è negativo ma il test sierologico è positivo, sono contagioso?

No. In questo caso il virus non è più presente nell’ organismo, rimangono solo gli anticorpi prodotti contro di esso ma non si è più contagiosi.

I test sono affidabili al 100% ?

Il test sierologico è molto affidabile, essendo effettuato su siero, se gli anticorpi sono presenti nel sangue verranno sicuramente rilevati. Per quanto riguarda il tampone purtroppo il rischio di imbattersi in un falso negativo è piuttosto alto, è un test strettamente dipendente dalla bravura dell’ operatore che quando effettua il tampone deve raggiungere i punti giusti.

 

Dove posso effettuare il test sierologico o il tampone?

L’analisi può essere eseguita presso il nostro centro medico o presso il nostro Laboratorio e punto prelievi di Milano. In alternativa, sempre nella città di Milano, è possibile richiedere il prelievo a domicilio.

Centro medico

Via G. Gallina, 10 – 20129 Milano
Tel. 02.58300445
info@imbio.it

Laboratorio e Punto prelievi

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Tel. 02.58300376
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ATTENZIONE: a causa dell’elevato numero di richieste i nostri centralini sono spesso occupati.
Lasciate un messaggio su whatsapp direttamente sul nostro cellulare +39 366 352 9609 e verrete ricontattati appena possibile.


Tempi, modalità e consegna dei referti 

I test diagnostici per la conferma dell’infezione da COVID-19 in Lombardia sono oggi eseguiti in diversi Laboratori pubblici o privati, comunque accreditati, autorizzati e coordinati dalla Direzione Welfare regionale.

La refertazione del test sierologico avviene generalmente entro 48 ore mentre la refertazione del tampone avviene generalmente entro 72 ore.

La consegna del referto avviene esclusivamente online tramite il nostro portale dedicato.

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Riferimenti:  Covid, Sistema immunitario, Tampone, Test sierologico, Coronavirus
Redattore: Dott. Stefano Frigerio

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